類器官是在體外培養(yǎng)的來源于干細(xì)胞的具有自組織特性的一種三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，是一種簡單的、微觀的器官模型。

一、類器官的分類

表1 類器官根據(jù)其來源的分類

1.多能干細(xì)胞來源的類器官

        多能干細(xì)胞具有無限自我更新并分化為幾乎所有器官特異性的細(xì)胞類型。ESCs來源于囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能干細(xì)胞，但因其應(yīng)用涉及到倫理問題導(dǎo)致其使用受限。iPSCs類器官的形成過程：

這些類器官培養(yǎng)基北京百奧創(chuàng)新科技有限公司可以提供，產(chǎn)品如下：

2.成體干細(xì)胞來源的類器官

        成體組織干細(xì)胞ASCs通常來源于患者的活檢組織，但其分化能力有限，而且ASCs類器官一般僅含有器官的上皮部分，缺乏基質(zhì)、神經(jīng)和血管系統(tǒng)，培養(yǎng)體系相對(duì)比較簡單，比如小腸類器官的培養(yǎng)：

3.腫瘤類器官        

       腫瘤類器官可保留腫瘤組織的生物學(xué)特征和異質(zhì)性，具有多次傳代后基因組保持穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短等優(yōu)勢，可作為腫瘤研究的理想模型。

二、類器官的構(gòu)建與培養(yǎng)

1.不同來源類器官的構(gòu)建
                                                     
2.以腸癌類器官為例的類器官培養(yǎng)步驟：

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）15 mL無菌離心管、1.5 mL離心管、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器、移液管、無菌槍頭等表面消毒后放入超凈工作臺(tái)中紫外照射30 min。

（2）提前30 min從4℃冰箱取出腸癌類器官培養(yǎng)基（北京百奧創(chuàng)新科技有限公司提供）平衡至室溫，提前1 h從-20℃冰箱取出所需體積的基質(zhì)膠冰上融化。

腸癌類器官培養(yǎng)

（1）將獲取的腸癌原代細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)算好的體積吸取細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的1.5 mL離心管中，補(bǔ)齊預(yù)冷的腸癌類器官培養(yǎng)基至所需體積。
（2）將預(yù)冷后的細(xì)胞懸液加入等體積的基質(zhì)膠中輕輕混勻（全程冰上操作），避免氣泡，使腸癌原代細(xì)胞終濃度為5×10⁵個(gè)細(xì)胞/毫升。然后將細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合液按照50 μL/孔呈半球形點(diǎn)膠于24孔板。
（3）將培養(yǎng)板放入5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱終至少30 min，待基質(zhì)膠*凝固。沿孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基，放置5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（4）3天后鏡下觀察類器官形成情況，粒徑大于30~50 μm即認(rèn)為類器官已經(jīng)形成。

（2）將預(yù)冷后的細(xì)胞懸液加入等體積的基質(zhì)膠中輕輕混勻（全程冰上操作），避免氣泡，使腸癌原代細(xì)胞終濃度為5×10⁵個(gè)細(xì)胞/毫升。然后將細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合液按照50 μL/孔呈半球形點(diǎn)膠于24孔板。
（3）將培養(yǎng)板放入5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱終至少30 min，待基質(zhì)膠*凝固。沿孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基，放置5%CO₂、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
（4）3天后鏡下觀察類器官形成情況，粒徑大于30~50 μm即認(rèn)為類器官已經(jīng)形成。

（5）每5天更換一次培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，持續(xù)觀察類器官大小，鏡下觀察大部分類器官大小均大于30~50 μm且大小不再增大即可收集類器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

腸癌類器官收集

（1）棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μL基質(zhì)膠解離試劑，室溫放置1 min，輕輕吹打混勻，收集至15 mL離心管中。

（2）50 rpm恒溫震蕩解離10-20 min，解離之后1500 rpm離心3 min，輕吸去上清，待用。

腸癌類器官傳代

（1）收集的類器官，加入適量的消化酶，37℃，200 rpm消化（具體時(shí)間根據(jù)類器官大小和數(shù)量決定，以肉眼可見顆粒明顯減小一半為準(zhǔn)，可中間取消化的類器官顯微鏡觀察，類器官消化至3~10個(gè)細(xì)胞集合體理想）。

（2）消化*后1500 rpm離心3 min，棄上清，使用清洗液重懸后1500 rpm離心3 min；加入預(yù)冷的腸癌類器官培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，計(jì)數(shù)，按照培養(yǎng)步驟操作繼續(xù)培養(yǎng)。

三、不同種類類器官形貌圖

(a)小腸類器官.(b)結(jié)腸類器官.(c)食管類器官.(d)胃類器官.(e)肝臟類器官.

(f)胰腺類器官.(g)肺類器官.(h)乳腺類器官.(i)腎類器官.(j)腦類器官.